实时荧光PCR技术在动物疫病诊断中的应用
近年来，实时荧光PCR技术在动物疫病诊断中的应用得到了进一步的发展，在诊断动物的病毒性、细菌性和寄生虫性疫病中得到了广泛的应用。实时荧光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，又可进一步提高灵敏度；实时荧光PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，实时荧光PCR技术将会在动物疫病诊断中得到更加广泛的应用。
实时荧光PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前报道的荧光探针主要有Taqman，Amplisensor，分子标信，Lightcyclor以及在这4种探针基础上发展起来的荧光探针。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且与常规的PCR相比，具有灵敏性和特异性高，能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。目前，已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域，特别是近几年来在动物疫病的诊断中得到了广泛的应用。
1 诊断病毒病
1.1 禽流感
禽流感病毒变异极为频繁，血清亚型众多，已报道的有15种血凝素HA亚型（H1～H15）和9种神经氨酸酶NA亚型（N1～N9）。禽流感病毒呈世界性分布，绝大多数禽流感病毒呈隐性感染，不表现临床症状，只有少数禽流感病毒具有迅速传播和高致病性的特性。国内外检测禽流感病毒的方法是OIE推荐的鸡胚病毒分离方法，该方法约需要耗时21 d，不适合禽类进出口的检疫和发生疫情时的及时诊断。张鹤晓等[1]根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列，开发、设计多条引物和探针序列，从中筛选敏感、特异的引物和探针，在循环参数、病毒核酸的提取方法、反转录条件的基础上，建立了快速的通用型“一步法”检测所有A型流感病毒的通用型荧光RT-PCR。该方法与鸡胚病毒分离相比，敏感性基本一致，可直接用来检测泄殖腔、喉拭子和禽肉，将检测时间从原来的21 d缩短为4 h。朱文斯等[2]根据禽流感病毒H5亚型的RNA 4节段设计了检测禽流感病毒H5亚型的引物和探针，其敏感性最高能达到10-7，该方法特异性强，与传染性法氏囊病毒中等毒力及弱毒疫苗、新城疫弱毒疫苗、传染性支气管炎弱毒疫苗、鸭瘟弱毒疫苗、鸭病毒性肝炎弱毒疫苗及有可能感染的禽流感病毒H9亚型、新城疫强毒、鸡传染性贫血病毒均不反应。
1.2 新城疫
新城疫病毒属于副黏病毒，根据毒株的致病力可分为强毒力型、中等毒力型及弱毒力型。OIE推荐检测新城疫病毒的方法是鸡胚病毒分离方法，需要21 d。张鹤晓等[3]建立的荧光RT-PCR方法不仅能将中强毒力新城疫病毒与弱毒区分开来，而且不与常见的禽类病毒发生交叉反应，其敏感性最高可达10-7。杨德胜等[4]利用荧光RT-PCR方法对910份样品进行新城疫病毒检测，阳性30份，并用鸡胚分离部分检测样品，结果完全一致。说明了荧光RT-PCR方法检测新城疫病毒具有敏感、特异、快速、准确、安全等特点。
1.3 口蹄疫
口蹄疫是一种危害偶蹄动物的烈性传染病，被OIE列为A类动物传染病之首。口蹄疫的暴发曾经给世界许多国家和地区的畜牧业及国际动物贸易带来灾难性的损失。口蹄疫病毒属于小RNA病毒科，为单股正链，血清型复杂多变，有7个血清型，即O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Aasia1型。传统的病毒分离鉴定方法耗时长，敏感性和准确性都较差，ELISA方法敏感性低，常规RT-PCR在大量样品进行检测的过程中容易被污染，以上方法难以适应当前口蹄疫防疫工作的要求。建立一种快速和可靠的诊断方法，对于控制和消灭口蹄疫至关重要。花群义等[5]根据口蹄疫病毒聚合酶3D基因片段非常保守的区域设计的引物、探针，扩增区内口蹄疫病毒 O型、A型、C型、Asia1型、SAT1～3型的序列相同，引物和探针是通用的，建立了荧光RT-PCR方法，对细胞培养物、水疱液、水疱皮及分泌物进行了检测，得到了满意的结果，与其他水疱性病毒不发生交叉反应。杨素等[6]应用荧光RT-PCR技术，利用O型口蹄疫病毒的5′端UTR区的IRES片段设计和合成了可检测7个血清型口蹄疫病毒群特异性引物和Taqman探针，结果表明敏感性高，特异性强，耗时仅为4 h，克服了传统的病毒分离鉴定方法耗时长，敏感性和准确性较差，而且容易造成病毒扩散及环境污染的缺点，适用于大批量样品的快速检测。
1.4 猪瘟
国内对猪瘟病毒的传统诊断方法包括免疫荧光试验、细胞分离培养、酶联免疫吸附试验、动物接种试验等，这些方法都存在不足之处。温国元等[7]在猪瘟病毒高度保守的5′端非编码区作为扩增靶区，设计了两对引物和一条Taqman探针，建立了荧光RT-PCR方法，该方法的检测灵敏度可达10拷贝/μL，对不同毒株以及各种组织样品检测结果均为阳性，该方法比RT-PCR灵敏度高100倍，与PCR具有相同的灵敏度。陈玉栋等[8]在猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株的5′端非编码区设计一对引物和一条荧光探针，结合Light Cycler检测系统，建立了定量检测猪瘟兔化弱毒疫苗的方法，该方法的灵敏度为100拷贝数，整个检测过程仅需4 h，该方法可望取代传统的兔体定型反应用于疫苗生产过程中的效价测定及指导疫苗的配制，也为猪瘟病毒分子生物学研究提供了一种新的、简捷有效的工具。
2 诊断细菌病
2.1 大肠埃希菌O157∶H7
大肠埃希菌O157∶H7是肠出血大肠埃希菌的一种主要血清型，可引起人出血性结肠炎、溶血性尿综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发症。该菌主要通过食物传播，动物是其主要的宿主。近年来国内外各个实验室诊断大肠埃希菌O157∶H7的检测方法不断出现，其中有PCR方法，多重PCR方法，但这些方法检测时间比较长，检测过程繁琐，不适合大规模动物产品的检测。Jothikumar N等[9]运用一种复合式Sybr Green实时荧光PCR方法快速测定大肠埃希菌O157∶H7，用一对特异引物同时扩增大肠埃希菌O157∶H7的类志贺毒素(stx1或stx2)基因。鉴于扩增后产生的两个PCR产物的Tm值不等,由此加以区别。此方法操作简便，快速，特异性好。张险朋等[10]应用实时荧光PCR方法对大肠埃希菌O157∶H7菌株检测为阳性，而大肠埃希菌O1∶H7，O119，O143及沙门菌无交叉反应，证明应用实时荧光PCR方法检测大肠埃希菌O157∶H7的特异性强，快速准确，适用于动物产品快速检测。
2.2 沙门菌
沙门菌的传统鉴定方法是挑取单个菌落进行生化方面的试验，而后利用血清凝集试验进行分型，由于方法本身的特异性问题而使鉴定的准确性和灵敏度较差，而且耗费大量的时间。赵雪涛等[11]根据沙门菌GenBank Accession NO U25352基因序列,设计并合成引物和Taqman探针，将PCR扩增的沙门菌基因片段克隆导入载体,构建的重组质粒经筛选、鉴定后,作为阳性模板,用于标准曲线的制定。利用荧光定量PCR技术进行各类菌株的定性鉴定。应用重组质粒制作的定量曲线,其循环阈值与模板浓度的对数值具有良好的线性关系,相关系数为0.999。检测各类菌株,其中沙门菌41株、H抗原丢失的沙门菌16株均呈阳性;非沙门菌109株均呈阴性。证明建立的沙门菌的荧光定量PCR方法简便、快速、准确。
2.3 炭疽芽孢杆菌
炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的人兽共患病，炭疽芽孢在环境中抵抗力极强，在军事上一直被列为头号生物战剂，快速检验和鉴定炭疽芽孢杆菌无论对人和草食动物炭疽病诊断，还是应对可能出现的生物恐怖袭击都十分重要。李伟等[12]采用实时荧光PCR技术，以pXO1质粒上的pag基因、pXO2质粒上的cap基因及染色体上的ropB基因设计引物和探针，应用上述基因探针的外标对照、pagA基因的内标对照等技术建立一种快速、准确、特异、定性、定量检测炭疽芽孢杆菌的方法。陈苏红等[13]以pXO1质粒上的pag基因及pXO2质粒上的cap基因为靶合成特异引物,用DNA嵌入荧光染料SYBR GreenⅠ进行定量PCR扩增,在PCR后进行熔解曲线分析，以确定得到的产物是否为目的产物。该方法检测炭疽芽孢杆菌的灵敏度达1 000拷贝。
2.4 胸膜肺炎放线杆菌
猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）有2个生物亚型和15个血清型，传统的检测方法有血清学方法和常规PCR方法，均存在不足之处。李树清等[14]根据APP apxⅣA毒素基因的序列设计了引物和探针，建立实时荧光PCR方法并初步应用，在150份样品中检出APP阳性23份。
3 诊断寄生虫病
王频佳等[15]利用扩增的弓形虫529 bp重复序列,经TA克隆后转化入大肠埃希菌DH5α中;提取重组质粒鉴定后,作为模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做重复性试验和临床标本检测，用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.995,试验间变异系数平均为3.28%,无非特异性扩增，样品检测阳性率为43.3%。建立了检测弓形虫基因的荧光定量方法,具有快速、灵敏、特异的特点。Woo T H等[16]以Light Cycler TM为平台，利用SYBR GreenⅠ作为荧光染料，建立了一种鉴定钩端螺旋体的实时 PCR方法,目标片段为16S rRNA,利用熔点曲线分析来区别特异产物、引物二聚体和非特异性产物,不需要电泳来鉴定,该方法快速而敏感,整个过程在20 min内完成。James A H等[17]用以ABIPrism7700SDS为平台，应用Taqman探针建立了从小牛腹泻粪便中定量检测小隐孢子虫cp11基因和18S rRNA的实时荧光PCR方法。
4 展望
由于实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量，此技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。实时荧光定量PCR解决了双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著[18-19]。由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。美国Texas大学的科研人员经反复实验，其结论是，内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法[20]。实时荧光PCR技术作为一种新的检测技术已广泛应用于动物疫病的诊断。目前，在动物疫病的诊断上，现已发展到至少有15种实时荧光PCR方法。市场上也出现一些动物疫病诊断的实时荧光PCR试剂盒。虽然实时荧光PCR的检测成本比较高，实时荧光PCR仪比较昂贵，但随着实时荧光PCR技术的进一步普及和发展，实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，以及它具有比传统病原学、血清学和常规的PCR更敏感、特异、无污染等优点，此技术将会在动物疫病诊断中得到更加广泛的应用。