01研究背景
脊髓损伤(SCI)是一种常见且严重的中枢神经系统损伤，可导致损伤平面以下神经功能障碍，诱导多能干细胞（iPSCs)可以个性化分化为神经干细胞(NSCs)，从而有效地为SCI提供移植细胞来源。近期，中南大学湘雅医院、中国科学院遗传与发育生物学研究所联合北京药理学与毒理学研究所在Cell Death & Bioactive Materials (IF 18.9) 上发表文章“Construction of functional neural network tissue combining CBD-NT3-modified linear-ordered collagen scaffold and TrkC-modified iPSC-derived neural stem cells for spinal cord injury repair”，基于TrkC修饰的iPSC衍生的NSCs和CBD-NT3修饰的线性有序胶原支架(LOCS)设计了功能性神经网络组织，并证实移植该组织可再生神经元和突触，改善损伤区域的微环境，增强细胞外基质的重塑，促进脊髓损伤模型大鼠后肢功能恢复。
02 结果展示
1. 基于LOCS和iPSCs构建功能神经网络组织
为了进一步探讨CBD-NT3和TrkC对体外功能神经网络组织构建的影响，作者设计了未经CBD-NT3修饰的LOCS和未过表达TrkC的iPSC-NSCs作为对照组。使用Lv-TrkC（维真生物提供）转染iPSCs，然后诱导其分化为NSCs，将CBD-NT3与LOCS孵育后，发现CBD-NT3能均匀地结合在LOCS上。为了确定CBD-NT3是否能与细胞膜上的TrkC结合，作者将CBD-NT3与细胞孵育，观察到NT3和TrkC的共定位，Western Blot发现，与未经CDB-NT3处理的iPSC-NSCs-TrkC细胞相比，CDB-NT3处理导致细胞中TrkC的磷酸化水平显著升高，表明CBD-NT3可以结合细胞表面表达的TrkC并激活NT3/TrkC。作者在CBD-NT3修饰的LOCS上接种iPS-NSCs- TrkC构建功能神经网络组织，发现CBD-NT3修饰的LOCS可促进iPS-NSCs-TrkC的存活和增殖。
图1 基于LOCS和iPSCs的功能神经网络组织构建
2. CBD-NT3修饰的LOCS和TrkC修饰的iPSC-NSCs构建了功能神经网络
作者发现LOCS+NT3+NSC-TrkC组表达胆碱能神经元标志物ChAT、谷氨酸能神经元标志物VGLUT1和成熟神经元标记MAP2的水平高于对照组，表明iPSC-NSCs-TrkC细胞在CBD-NT3修饰的LOCS中有分化为兴奋性神经元的潜力。此外，在LOCS+NT3+NSC-TrkC组中检测出更多的突触素标记物SYN和突触后密度标记物PSD95，表明LOCS+NT3+NSC-TrkC组在体外3D培养过程中具有更高的突触形成潜力。作者还在LOCS+NT3+NSC-TrkC组中观察到细胞已经分化，细胞表面出现轴突样突起，细胞通过这些过程相互接触，形成类似神经连接的网络结构，表明CBD-NT3修饰的LOCS和TrkC修饰的iPSC-NSCs可以用来构建功能神经网络组织。
图2 CBD-NT3修饰的LOCS和TrkC修饰的iPSC-NSCs构建了功能神经网络
3. 功能神经网络组织移植促进脊髓损伤区神经元再生
作者构建全横断面SCI模型，研究功能性神经网络移植对SCI的影响，发现功能性神经网络组织移植可以显著改善脊髓损伤区微环境，促进细胞外基质重塑。作者还测定了脊髓损伤区下行神经元的恢复情况，发现LOCS+NT3+NSC-TrkC组的5-HT阳性神经纤维遍及脊髓损伤区域，明显优于其他对照组，说明功能性神经网络组织植入脊髓损伤区可以建立损伤区与宿主脊髓之间的神经联系，重塑下行神经元功能。ChAT和VGLUT1在LOCS+NT3+NSC-TrkC组的表达也更高，说明功能性神经网络组织在促进兴奋性神经元再生方面更有优势。此外，LOCS+NT3+NSC-TrkC组在脊髓损伤区中央发现形态结构正常的神经元，并在LOCS周围生长和延伸，表明移植组织与受伤部位建立了神经连接，并作为神经回路的中继站。
图3 功能神经网络组织移植促进脊髓损伤区神经元再生
4. 功能神经网络组织移植可改善脊髓损伤大鼠运动功能
作者在移植手术后评价了大鼠的后肢运动功能，发现LOCS+NT3+NSC-TrkC组大鼠BBB评分优于其他组；斜网格攀爬结果证实，LOCS+NT3+NSC-TrkC组大鼠后肢表现出明显的自主运动，运动功能和协调能力均有明显恢复。动物步态分析结果表明LOCS+NT3+NSC-TrkC组的大鼠恢复情况符合动物步态分析要求，停留强度曲线证实LOCS+NT3+NSC-TrkC组大鼠的两条后肢都能负重并在行走时移动。这些结果证实了LOCS支架移植可促进脊髓损伤大鼠后肢功能的恢复，基于CBD-NT3修饰的LOCS和TrkC修饰的iPSC-NSCs功能性神经网络组织可以进一步显著改善运动功能。
图4 功能神经网络组织移植可改善脊髓损伤大鼠运动功能
03实验结论
本研究首次尝试利用iPSc-NSCs作为种子细胞，基于受体和配体的相互作用构建功能性神经网络组织，有效地为外源NSCs的个性化获取提供了解决方案，拓展了iPSC-NSCs和LOCS在脊髓损伤修复研究中的应用前景，为脊髓损伤再生修复提供了一种新的生物材料设计思路。