骨骼存在于人和动物体内，为肌肉、肌腱和韧带提供了附着点，从而使运动成为可能。骨骼细胞谱系涵盖了在稳态和损伤期间分别维持和修复骨骼的多种细胞，包括成骨细胞、骨细胞和软骨细胞，这些骨骼细胞类型主要参与骨骼和软骨的形成，而负责骨骼吸收的破骨细胞则来自造血谱系。通过成骨细胞和破骨细胞活性之间的平衡来维持正常的骨稳态。骨骼系统通过其支撑身体、保护内脏器官、参与运动功能、造血功能以及调节矿物质平衡等主要作用来维持身体健康，但由于多种因素的相互作用，机体功能易出现退化，容易导致骨骼疾病的发生，对人们的生活造成诸多困扰。
AAV凭借安全性高、免疫原性低、宿主范围广及表达稳定等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，目前已被广泛应用于多种疾病的基因治疗。本期我们将和大家一起学习AAV在骨骼系统中的应用方法。
温馨提示：以上来自于文献报道，AAV在骨骼系统中的转导效率应结合血清型、启动子及注射方式等多方面综合考虑，建议在进行实验前根据具体想要感染的组织细胞查阅相关文献并进行预实验的摸索。
一. AAV血清型
案例 1
研究团队评估了在体外不同AAV血清型对小鼠颅骨成骨细胞（COB）、骨髓衍生的破骨细胞前体（BM-OCP）和软骨细胞祖细胞（ATDC5）的转导效率，发现rAAV1，rAAV4，rAAV5，rAAV6，rAAV7，rAAV9，rAAVrh.10和rAAVrh.39这八种AAV载体能够高效转导COB。其中，rAAV1，rAAV4，rAAV5，rAAV6，rAAV7和rAAV9也能转导BM-OCP，而rAAV1，rAAV6，rAAVrh.10和rAAVrh.39则能转导ATDC5；此外，rAAV2和rAAV6.2实现了ATDC5细胞的有效转导，但在COB中转导效果较差。接着，将体外筛选出的八种血清型AAV通过关节腔注射到2月龄小鼠体内，发现仅AAV9能够有效转导成骨细胞、破骨细胞和骨细胞等。
（Yang YS, et al. Nat Commun.2019）
实验动物
2月龄雄性小鼠
血清型
AAV1/4/5/6/7/9/rh.10/rh.39
启动子
CB
注射方式
膝关节内注射
病毒用量
1×1011 、5×1012 GC/kg、10μL
案例 2
通过膝关节注射不同AAV血清型（AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 6.2, rh8, rh10, rh39, rh43）至不同样本软骨组织中，发现与其他AAV血清型相比，AAV2和AAV6.2在体内外软骨细胞的基因递送中均表现出很高的转导效率。
不同AAV血清型在小鼠软骨组织中的转导效率比较
（Dong Suk Yoon,et al. Int. J. Med. Sci. 2021）
实验动物
ICR小鼠
血清型
AAV1/2/3/4/5/6/7/8/9/6.2/rh8/rh10/rh39/rh43
注射方式
关节内注射
病毒用量
1×1010 GC，6μL
二. 启动子
为增强AAV对骨骼系统的特异性靶向，除了可以选择CMV等广谱启动子外，还有多种骨骼特异性启动子：
体内用于靶向成骨细胞和骨细胞的启动子概述
（Kitase Y, Prideaux M. Bone. 2023）
在CAG、Col2.3和Sp7三种启动子的驱动下，将AAV8-tdTomato（5×1011vg）经尾静脉注射至小鼠体内，检测发现三种构建体均成功转导胫骨细胞；值得注意的是，骨特异性启动子Col2.3和Sp7驱动的tdTomato表达与成骨细胞标记物AP共定位且转导水平相似。其中Col2.3介导骨膜和成骨细胞的转导，而Sp7主要介导成骨细胞的转导。
全身给药后，携带骨细胞特异性启动子的AAV8选择性靶向成骨细胞
（ Lee, Lucinda R. , et al. Methods, Clinical Development. 2019）
三. 注射方式
针对骨骼系统的AAV注射方式可分为三种：针对骨骼系统特异性的骨关节腔注射、静脉注射以及针对骨髓的骨内注射。关节腔注射（Intra-Articular Injection）是首选的给药方法。与全身给药相比，关节内注射降低了非靶器官发生不良事件的可能性，提高了治疗药物在关节腔内的有效浓度，并且降低了成本。通过该注射方式给药AAV可以将基因高效的传递至关节，滑膜中的成纤维样滑膜细胞（FLS）、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞等均可被有效转导。
操作步骤（以膝关节注射为例）：
1) 抓握固定小鼠，对膝关节作备皮处理；
2) 用75％乙醇消毒后，握紧小鼠下肢，屈曲60°；
3) 取微量注射器于髌骨下方腱外缘进针，稍向内下穿过关节囊后即感到有落空感，此时不再进针并缓慢注射，注射完毕后静置10s；
4) 旋转拔出注射器，对注射位置作75％乙醇消毒处理。
小鼠膝关节注射示意图
（https://www.clodrosome.com/animal-injection/）